ВЕРО ЭС ХОРДУУЛАГЧ ESCHERICHIA.COLI

Товчлол

E.coli нь  мал амьтан, хүний ходоод гэдэсний замд байнга оршиж байдаг хэвийн бичил биетэн юм. Зарим омог нь  хувьсал хөгжлийн явцад чацга алдах  болон  ходоод гэдэсний зарим эмгэгийг үүсгэх шинжийг олжээ. 1977 оны үеэс чацга алдуулалт үүсгэдэг E.coli- ийн зарим омог нь веро эсэд өсгөвөржихдөө эсийг эргэшгүй эмгэгшүүлдэг хор үүсгэдэг  болохыг тогтоожээ. Йим  веро эс хордуулагч E.coli (VTEC) –д 100 гаруй   йилдсэн хэвшил хамаарагдана. Escherichia.coli О157:Н7 нь   Дотуур цус харвалт үүсгэгч E.coli (EHEC) гэж тодорхойлогддог, (VTEC) –н эмгэг төрүүлэгч бүлэгт хамаарагдах хамгийн  хоруу чанартай зонхилох йилдсэн хэвшил юм. Энэ тодорхойлолт нь уг нянгийн хүний бүдүүн гэдэсний  цусархаг үрэвсэл, цусаар шээх хам шинж үүсгэх чадавхи, веро эсийн хор үүсгэх болон хучуур эсэд холбогдож  гэмтээх  шинж чанар, онцгой шинж бүхий том плазмидтай байх зэргээс үндэслэсэн байдаг. Сүүлийн 20 жил VTEC E.coli О157:Н7 нь дэлхий дахиныг хамарсан нийгмийн эрүүл мэндийн чухал асуудал болон тавигдах  болжээ. О157 биш бусад ийлдсэн бүлгүүдэд багтах  О26, О91, О103, О104, О111, О113, О117, О118, О121, О128, О145 нь хүнд хааяа тохиолдох дэгдэлттэй холбоотой бол бусад нь маш ховор тохиолддог байна. VTEC E.coli- ийн байгалын үндсэн тээгч эзэн нь хивэгч амьтад бөгөөд тэдгээр тээгч нь ихэнхдээ эрүүл амьтад байна. VTEC – ийг мөн гахай, муур, нохой, тахиа, зэрлэг шувуунаас ялган авсан байдаг. Хүнд халдвар үүсгэгч  E.coli О157:Н7-ийн үндсэн эх уурхай нь үхэр гэж үзсэн байдаг. Хүнд эмгэг төрүүлэх чанараас үл хамаарч  мал амьтан  E.coli О157:Н7-оор мал амьтанд үүсэх халдвар нь ихэвчлэн шинж тэмдэггүй байдаг. EHEC ийлдсэн бүлгүүдийг харьцуулж үзэхэд О26,О111,О113 нь хүн мал амьтанд хоёуланд нь эмгэг үүсгэж болно.Мал амьтны баасанд байх эдгээр бичил биетэн хүнсний сүлжээнд нь бохирдсон сүүн бүтээгдэхүүн, мал нядлах явцад  ходоод гэдэсний агуулагдахуунаар бохирдох эсвэл халдвартай бордоо хэрэглэсэн жимс хүнсний ногоогоор дамжин нэвтрэх нөхцөл бүрдэнэ. Мөн бохирдсон ус болон халдвартай хүн, мал амьтнаас шууд хавьтлын замаар дамжина.

Үүсгэгчийг тодорхойлох: Мал амьтны ялгадас, эмгэгт дээж болон хүнсэнд бага тоогоор агуулагдах E.coli О157:Н7-г ялган оношлох аргууд боловсронгуй болсоор ирсэн. E.coli О157:Н7-г тээгч шинж тэмдэггүй мал амьтнаас уг үүсгэгчийг илрүүлэх шинжилгээ нь баяжуулах шингэн орчиноос шалтгаалдаг ба ихэвчлэн буфержүүлсэн пептонт ус (ванкомицин, цефсулодин, цефиксим антибиотикийн нэмэлттэй болон нэмэлтгүй) ашиглах ба 37°с хэмд 6 цаг баяжуулан дараа нь дархлаат соронзон таталцлаар ялгах  аргыг ашиглана. Үүнд худалдаанд байдаг О157липополисахаридын эсрэг үүссэн эсрэгбиемээр бүрсэн соронзон шүрийг ашигладаг. Үүсгэгч уг эсрэгбиемээр бүрсэн шүртэй холбогдох ба уг шүрийг 1%сорбиттой Мак Конки (Цефиксим болон Теллурит Калитай) орчинд тарилт хийн 37°с хэмд 18 цаг өсгөвөрлөнө. Сорбит задалдаггүй колонийг биохимийн шинж болон О157 биеийн болон Н7 шилбүүрийн эсрэгтөрөгч байгаа эсэхийг наалдуулах урвалаар баталгаажуулна. Хүнд хоруу чанартай (веро эс хордуулагч хор ялгаруулдаг) эсэхийг веро эс эмгэгшүүлэх арга,фермент холбоот эсрэгбием/эсрэгтөрөгчийн арга,наалдуулах урвал,полимераза гинжин урвалаар тус тус тодорхойлдог. Өндөр төвшний лавлагаа лабораториуд VTEC О157 –н дэд хэвшлийг тархвар судлалын зорилгоор PFGE болон хэвшил өвөрмөц фагын аргуудаар тодорхойлдог.

Ийлдэс судлалын аргууд: Серологийн аргууд малын VTEC халдварыг оношлоход тэр болгон өргөнөөр ашиглагддаггүй. Гэхдээ Элизагаар халдвартай үхрийн ийлдсэнд  О157 эсрэгбиемийг илрүүлж болох нь тогтоогдсон.

Танилцуулга

E.coli нь мал амьтан, хүний ходоод гэдэсний замд байнга оршиж байдаг хэвийн бичил биетэн бөгөөд зөвхөн зарим нэг омгууд нь чацга алдалт болон ходоод гэдэсний эмгэг үүсгэх шинжийг олсон байна. E.coli –н биеийн О, шилбүүрийн Н, бүрээсийн К эсрэгтөрөгчийг серологийн аргаар хялбархан илрүүлж болдог. 1977 оны үеэс чацга алдуулалт үүсгэдэг E.coli- ийн зарим омог нь веро эсэд өсгөвөржихдөө эсийг эргэшгүй эмгэгшүүлдэг хор үүсгэдэг  болохыг тогтоожээ. Дээрх веро эс хордуулагч E.coli (VTEC) –д 100 орчим төрлийн ийлдсэн хэвшил хамаарагддаг. Дээрх хэвшлүүдийн ялгаруулдаг веро эс хордуулагч хор нь  shigella.dysenteriae –ийн ялгаруулдаг шига хортой (stx) маш ижил төстэй тул мөн (STEC) шига хор ялгаруулагч E.coli гэж нэрлэгддэг. Сүүлийн 20 жил VTEC E.coli О157:Н7 нь дэлхий дахиныг хамарсан нийгмийн эрүүл мэндийн чухал асуудал болон тавигдах  болжээ. Escherichia.coli О157:Н7 нь   Дотуур цус харвалт үүсгэгч E.coli (EHEC) гэж тодорхойлогддог, (VTEC) –н эмгэг төрүүлэгч бүлэгт хамаарагдах хамгийн  хоруу чанартай зонхилох йилдсэн хэвшил юм. Энэ тодорхойлолт нь уг нянгийн хүний бүдүүн гэдэсний  цусархаг үрэвсэл, цусаар шээх хам шинж үүсгэх чадавхи, веро эсийн хор үүсгэх болон хучуур эсэд холбогдож  гэмтээх  шинж чанар, онцгой шинж бүхий том плазмидтай байх зэргээс үндэслэсэн байдаг. О157 биш бусад ийлдсэн хэвшил болох О26:Н11, О104:Н21, О111, О145 нь хүнд хааяа тохиолдох дэгдэлттэй холбоотой бол бусад нь маш ховор тохиолддог байна. Хивэгч мал амьтад VTEC –ийн үндсэн тээгч, тараагч  амьтад болдог. Мөн VTEC нь гахай, муур, нохой, тахиа болон зэрлэг шувуудаас илэрдэг. VTEC нь дээрх зүйлийн амьтдад түр хугацаанд шимэгчилдэг байна. VTEC бүлгийн О45:К, О138:К81, О139:К82, О141:К зэрэг 4 хэвшил нь гахайн торойд хаван үүсгэдэг болох нь тогтоогдсон байна. Эмнэлзүйн шинж тэмдэг болон хоруу чанарыг нөхцөлдүүлэгч  үндсэн хүчин зүйлс нь фимбрийн адгезин, F18, VT2e хор зэрэг юм. Хүнээс болон гахайнаас ялган авсан stx2е генийг агуулсан О101 омог нь хоорондоо удамшлийн мэдээллийн хувьд маш ойролцоо байсан нь судалгаагаар тогтоогджээ. Хүний өвчлөлд STEC-г шинж тэмдэггүйгээр тээж буй гахайн үзүүлэх нөлөө оролцоог цаашид судлах нь чухал байна.

Оношлогооны арга техникүүд

Дээж авах

Ихэнх тохиолдолд хүнд уг өвчний дэгдэлт гарсны дараа эпидемиологийн шалтгааныг илрүүлэх мөрөөр нь хөөх зорилгоор мал амьтдын ялгадас баасыг шинжилгээнд зориулан авдаг. Малын шулуун гэдэснээс, шинэхэн шингэн баас эсвэл нядалсны дараа ходоод гэдэсний агуулагдхуунаас дээж авч болно. E.coli О157:Н7-г тээгч мал амьтан ялангуяа үхэр ямар нэг эмнэлзүйн шинж тэмдэг үзүүлдэггүй бөгөөд уг үүсгэгч маш бага тоотойгоор агуулагддаг байна. Сүргийн дотор зөвхөн тодорхой хэмжээний мал илрэх хэмжээний үүсгэгч агуулж байдаг.Тээгч мал амьтан ихэнхдэээ уг үүсгэгчийг маш бага тоогоор түр хугацаанд ялгаруулж байдаг ба энэ нь малын нас, тэжээллэг, стресс, популяцийн нягтрал, газарзүйн байршил, улиралаас шалтгаалдаг. Шулуун гэдэсний салснаас бойтуураар дээж авах нь сайн аргад тооцогддог ба дээж авсан даруйд хөндлөнгийн бохирдлоос сэргийлэн сайтар битүүмжлэн лаборатори руу хүргэнэ. Дээжийг аль болох хурдан хөргүүрт хийх ба өсгөвөрлөнө.

Аюулгүй байдал

VTEC эерэг гарсан дээжнүүдтэй маш болгоомжтой харьцана. Учир нь E.coli О157:Н7 –ийн хүнд хордлого үүсгэх тун нь маш бага байдаг (100 нянгийн биет хүртэл ) лабораториос гаралтай хүний халдвар нилээд хэд тэмдэглэгдсэн байдаг. Аюулгүй ажиллагааны талаар 1.1.2-р бүлгийг үз

Ялгаварлан өсгөвөрлөх

а) Баяжуулах шингэн орчин: VTEC нянг тээгч малын баасанд уг үүсгэгч маш цөөн тоотой байдаг тул эхлээд заавал  баяжуулах шингэн орчинд өсгөвөрлөнө.Голчлон буфержүүлсэн пептонт ус ашиглах ба ванкомицин 8мг/л,цефсулодин 10мг/л,цефиксим 0,05мг/л(BPW+VCC) хэмжээтэй нэмдэг нь грам эерэг болон Aeromonas spp, Proteus spp ургалтыг саатуулах ач холбогдолтой.Мөн  20мг/л новобиоцин, 20мг/л акрифлавины нэмэлттэй сайжруулсан триптиказ буурцагтай шөл (mTSB) –ыг ашиглаж болно.Үхрийн ялгадасыг бусад нянгийн эрчимтэй ургалтаас сэргийлж 37°с- д  6 цаг ургуулна. Махны дээжнийг 41-42 °с-д 6 цаг, ус сүүний дээжийг 41-42 °с-д 24 цаг өсгөвөрлөнө.

б) Дархлаат соронзон таталцлаар ялган тусгаарлах арга  (IMS): Энэ арга нь дээжинд харьцангуй бага тооны (10 хүртэл ) E.coli О157:Н7 байгаа тохиолдолд ашиглагддаг сонгомлоор өтгөрүүлж баяжуулах арга юм.Үндсэн зарчим нь липополисахаридын эсрэг үүссэн эсрэгбиемээр бүрсэн шүрийг тодорхой хэмжээний  баяжуулсан дээж бүхий шөлөөр үйлчлүүлж угаасны дараа шүр  нянгийн нэгдэл соронзон орны үйлчлэлээр шингэний дээд хэсгээс шүр рүү нэвтэрч орон сонгомлоор холбогдоно. Тэгж угаагдсан шүрийг сонгомол хатуу орчинд 37°с- д  18цаг өсгөвөрлөнө. Уг арга нь ийлдсэн хэвшил өвөрмөц байдаг.

с) E.coli О157-г өсгөвөрлөх арга: VTEC E.coli О157:Н7  бусад E.coli-гоос D-сорбит задалдаггүй, β глюкуронидаза идэвхгүйг эс тооцвол биохимийн бусад шинжээр бараг ялгагддаггүй. 1% D-сорбит агуулсан Мак Конки орчныг ихэвчлэн ашигладаг.Сонгомол чанарыг нэмэгдүүлэх зорилгоор рамноз 0.5%, цефиксим 0.05%- иар нэмж (CR-SMAC) Proteus төрлийн ургалтыг дарангуйлна. Рамноз үнэтэй тул теллурит калийг (2.5мг/л) цефиксим дээр 0.05% нэмж (CT-SMAC) орлуулж болдог.Энэ орчин нь E.coli О157-г ялгаварлан өсгөвөрлөх хамгийн түгээмэл ашиглагдаж байгаа төдийгүй бусад E.coli болон сорбит задалдаггүй нянгууд болох Aeromonas, Plesiomonas, Morganella, Providencia зэрэг нянгуудын ургалтыг дарангуйлна. β глюкуронидаза ялгаруулдаг  E.coli О157:Н7-г β глюкуронидаза ялгаруулдаггүй  E.coli-с ялгах зориулалттай флуороген болон хромоген зэрэг тодруулагч бодистой агаруудыг сүүлийн үед ихээр ашиглаж байна. Нянгийн β глюкуронидаза ферментийн нөлөөгөөр 4-метилумбеллиферилбета-Д-глюкуронид(MUG) задарч флюресценц нэгдэл үүсгэж хэт ягаан туяагаар харж ялгах боломж бүрдүүлдэг. Мөн  SMAC- д 0.1г/л  5-бромо-4-хлоро-3-индоксил-бета-Д- глюкуронид (BCIG) нэмснээр өнгөгүй E.coli О157:Н7-н колонийг сорбит задалдаггүй β глюкуронидаза эерэг хөх ногоон колони бүхий нянгаас ялгах боломжтой болдог.

E.coli O157 H7 сонгомол агарт ургах байдал: Теллурит цефиксимтэй сорбитол Мак Конки (TC-SMAC). E.coli O157H7 нь сорбитол задалдаггүй ба теллурит кали нь бусад организмын ургалтыг саатуулдаг. Уг орчин дээр өнгөгүй тэгш захтай колони ургадаг.

Сэжигтэй колонийн шинж чанарыг тодорхойлох

Хатуу тэжээлт орчин дээр ургасан VTEC-ийн төстэй колонийн биохимийн болон генотипийн шинж чанарыг судална. Гахайнаас ялгаж авсан E.coli О157 зарим хэвшил веротоксин ялгаруулдаггүй болон хүнд эмгэг үүсгэдэггүй байсан байна. Хоруу чанарыг нөхцөлдүүлэгч болох VT1(stx1), VT2(stx2)  болон eae генүүдийг тодорхойлно.

а) Биохимийн шинжилгээ: VTEC E.coli О157:Н7 нь бусад E.coli-гоос сорбит задалдаггүй, β глюкуронидаза идэвхгүй зэрэг шинжээр ялгагдахаас өөр биохимийн хувьд ялгаагүй. E.coli нь E.hermanii-с цианид калитай орчинд ургадаггүй, целлобиоз задалдаггүй гм шинжээр ялгагддаг. E.hermanii нь дээрх 2 тестед эерэг байдаг. E.hermanii –н 98% нь мах пептоны агар дээр өвөрмөц шар пигмент үүсгэдэг онцлогтой.

б) Серологийн шинжилгээ: О157, О26, О91, О103, О111, О128, О148 болон Н7 хэвшлүүдийг тодорхойлох латекс наалдуулах урвалын цомогийг янз бүрийн компаниуд үйлдвэрлэдэг ба эерэг сөрөг болон хяналтын латекс урвалжууд  хамтдаа байдаг.

с) Веро эсийн өсгөвөрт хор ялгаралтыг тодорхойлох шинжилгээ: Веро эсийн өсгөвөрт хор ялгаралтыг тодорхойлох шинжилгээ нь веро токсин илрүүлж  батлах стандарт арга хэвээр байсаар байна. Веро эсийн плазмийн мембран нь өндөр өтгөрүүлэг бүхий глоботриаосилцерамид (Gb3) , (Gb4) гэх веротоксинтой холбогдох авуурыг агуулдаг. Уг тестийг баасны шингэн, өсгөвөрийн шүүгдэс, амьд өсгөвөр зэрэгт тавьж болдог. Мэдрэг чанарыг дээшлүүлэх зорилгоор суспензийг полимиксин B, митомицин зэргээр боловсруулдаг. Хэдийгээр мэдрэг чанар өндөртэй арга боловч эсэд халдвар хийсний дараа 3-4 өдрийн дараа үр дүн нь гардаг, хөдөлмөр их шаарддаг тул энгийн лабораторид хийхэд бэрхшээлтэй байдаг.

d)  E.coli О157-н дэд хэвшлийг тархвар судлалын зорилгоор тодорхойлох: Хүний өвчлөлтэй холбоотой  E.coli О157:Н7-ийг лавлагаа лабораторид тодорхойлох хэд хэдэн арга байдаг. Нилээд олон арга байдгаас төрөл өвөрмөц фагын арга болон фулсед гел электрофорезийн  аргууд голдуу хэрэглэгддэг. Нийгмийн эрүүл мэндийн лавлагаа лабораторийн түвшинд Фулсед гел электрофорезийн  арга нь VTEC E.coli О157 болон дэд хэвшлийг тодорхойлох стандарт арга болсон.

VTEC-ийг өсгөвөрлөхөөс бусад аргаар оношлох

Хэдийгээр VTEC-н халдварыг өсгөвөрлөж цэвэр өсгөвөр гарган аван шинж чанарыг судлах нь найдвартай шийдвэрлэх арга ч гэсэн энэ нь маш цаг хөдөлмөр шаардсан арга байдаг. Иймээс О болон Н эсрэгтөрөгчийг илрүүлэх янз бүрийн дархлалын болон нуклейн хүчлийн эрлийзжүүлгийн аргууд гарч ирсэн.

а) Дархлал судлалын аргууд: Дархлал судлалын аргаар VTEC-н  О болон Н антигенийг эмгэгт дээж болон хүнс гадаад орчны дээжинд ялган авсан өсгөвөрт батлах сорил болохоос гадна бусад арга болох пенсайд мембран арга,колони иммуноблот,Элиза зэрэг нь  нилээд хугацаа хэмнэсэн өсгөвөрлөхөөс өмнөх шигших буюу скринингын аргууд болдог. Ихэнх аргууд нь О157 липополисахарид болон Н7 шилбүүрийн  антигенийг илрүүлэхэд зориулагдсан байдаг. Хор тодорхойлох арга нь бүх VTEC-г илрүүлэх давуу талтай байдаг бол зөвхөн О157 болон Н7-г илрүүлэх иммуноферментийн оношлуурууд байдаг. Иммуноферментийн урвалын гол ашиглагддаг формат нь сэндвич урвал юм. Уг форматын хувьд эсрэгбием өвөрмөцөөр VTEC эсрэгтөрөгчтэй холбогдон дараа нь тухайн тохиромжтой субстратыг нэмсний дараа фермент холбоотой хоёрдогч эсрэгбием уг эсрэгтөрөгчтэй холбогдон өнгөний урвал үүсгэдэг. Уг цомог нь баталгаажсан урвалж болон урьдчилан баяжуулах аргачлалаар  хангагдсан байдаг. Тухайн оношлогооны цомгууд нь гулууз,хүнсний бүтээгдхүүн болон хүний эмгэгт дээж шинжилхэд зориулагдан баталгаажсан байвал мал амьтны ялгадасны дээж шинжлэхэд мэдрэг чанар багатай байж болно.Иммунологийн аргууд нь зөвхөн таамаглах үр дүн өгдөг тул оношийг өсгөвөр гарган авч О157 антиген болон хор ялгаруулагч  нянгийн өвөрмөц шинжийг тодорхойлсноор баталгаажуулна. Цомогууд нь байнга өөрчлөгдөж байдаг ба OIE лавлагаа лаборатори хамгийн сүүлийн үеийн баталгаажсан оношлуурын талаарх мэдээллээр байнга хангаж байх болно.

б) Нуклейн хүчлийг тодорхойлох аргууд

i) Колони эрлийзжүүлгийн арга: Энэ  нь VTEC-г холимог өсгөвөрт илрүүлэх чухал арга юм.ДНХ болон нийлэг олигонуклеотидын пробуудыг  дигоксигенин болон биотин зэрэгтэй холбосон байдаг тул энгийн лабораторид ашиглахад зохимжтой байдаг.Уг арга нь VT ген болох E.coli О157-н  60MDa плазмид болон еае генийг тусад нь болон хамтад нь илрүүлдэг.

ii) ПГУ-р VT ген болон бусад хоруу чанар тээгч хэсгүүдийг тодорхойлох: Маш олон VT1, VT2 болон VT2-ийн хувилбар генүүдийг илрүүлэх ПГУ-г хорын хэвшил тодорхойлох ПГУ-тай харьцуулсан судалгааны ажил хийгдсэн байдаг.Учир нь VTялгаруулагч генийг тодорхойлсон ч энэ нь хор ялгаруулагч генийг экспресслэж байгаа эсэхэд баталгаа болж чаддаггүй. ПГУ-г мөн цэвэр холимог агартай өсгөвөр, шөлөн өсгөвөр, хүнс, ялгадас зэрэг темплейтүүдэд тавьж болдог. Энэ нь үхсэн эсийн генийг тодорхойлох чадвартай байдаг. Оношлогооны ач холбогдлын хувьд  ПГУ-г VTEC-н халдварыг эпидемиологын зорилгоор дээжинд скрининг(шигших) шинжилгээ хийх боломжтой арга юм. Ялгадас нь ПГУ-г саатуулагч өвөрмөц бус зүйлсийг агуулж байдаг ба эдгээр саатуулуурыг арилгагч төгс арга одоог хүртэл арга байна. Шинжилгээ хийхээс өмнө сонгомол бус баяжуулалт хийж мэдрэг чанарыг нэмэгдүүлж болдог боловч урвалын мэдрэг чанараараа дархлаат соронзон таталцлын урвал(IMS),  Веро эс эмгэшүүлэх урвалаас доогуур хэвээр байна. VTEC-н бусад хүнд эмгэг төрүүлдэг генүүд болох еае (интиминийг кодлогч), ehx(Энтерогемолизиныг кодлогч), fliC (Н7-г кодлогч), uidA (мутант β глюкуронидаза сөрөг E.coli О157:Н7 кодлогч), katP (E.coli О157:Н7-н каталаз пероксидазыг кодлогч плазмидад агуулагдах ген) зэргүүдийг тодорхойлох ПГУ, ДНХ проб, Микро эррей (Олигонуклеотидыг 2D хэмжээсээр хатуу субстрат дээр жагсааж тодорхойлох арга) аргууд боловсронгуй болсоор байна. Хэд хэдэн генийг зэрэг тодорхойлох нийлмэл шинжилгээний аргууд боловсронгуй болсоор байна.

E.coli О157:Н7-г скринингийн зорилгоор ялгадсанд тодорхойлох

E.coli О157:Н7-н гол халдвар тараагч тээгч нь мал амьтад ялангуяа үхэр юм. Скрининг нь эмгэгт дээжинд харьцангуй бага тоотой агуулагдаж буй E.coli О157:Н7-г стресстсэн үед болон бусад өрсөлдөгч бичил биетээс сэжигтэй колонийг өсгөвөрлөн гарган авах арга дээр үндэслэгддэг.

а) Урьдчилсан баяжуулалт

i) Ялгадасны дээжийг ариутгасан битүүмжлэлтэй 4°с бүхий саванд хийн аль болох хурдан өсгөвөрлөнө (дээж авсанаас хойш 2цагын дотор). Удаан хугацаагаар хадгалах бол -70°с-д хадгална.

ii) Ялгадасны дээжийг бүлээсгэсэн буфержүүлсэн пептонт усаар (BPW) 1:10-р шингэлнэ.

iii) Дулаан тогтоогуурт 37°с±2°с-д 6 цаг тавина.

iv) Эерэг сөрөг хяналтыг хамтад нь явуулна.

b) Дархлаат соронзон таталцлаар ялган тусгаарлах арга.

i) Dynabead® E.coli О157-н эсрэг үүссэн эсрэгбиемээр бүрхэгдсэн шүрийг(Dynal biotech, ASA, Oslo, Norway) ашиглана.

ii) Үйлдвэрлэгчийн зааврийг дагах ба дархлаат соронзон аргыг  урьдчилан баяжуулсан дээжин дээр ашиглахдаа гар ажиллагаагаар (MIMS) эсвэл автомат(AIMS) аргыг ашигладаг.Ашиглахаас өмнө шүрийг сайтар сэгсэрч холихдоо маш болгоомжтой ажиллах ба бэлдсэн хуруу шилэнд хийхдээ хөндлөнгийн бохирдлоос болгоомжлох хэрэгтэй. Хэрэв гар ажиллагаат аргыг сонгосон бол шүр нянгын нэгдлийг угаахдаа маш болгоомжтой ажиллах нь чухал байдаг.

iii) Сүүлчийн угаалтын дараа бичил соруур ашиглан 50μl нян шүрийн холимгийг цефиксим болон теллурит кали агуулсан Мак Конки орчин(CT-SMAC) дээр тарилт хийнэ.

iv) Ариун бойтуур  ашиглан аягыг 3хуваасны 1 хэсэгт нян шүрийн нэгдлийг хагалж тараана. Тэгээд ариутгасан 10μl-н урхиар колони салгах аргаар цаашид шингэлэн  дан колони гаргахаар салган таталт хийнэ. Дулаан тогтоогуурт 37°с±2°с-д 16-18 цаг тавина.

с) Колонийг тодорхойлох арга

i) 10ширхэг өнгөгүй сорбит задлаагүй колонийгсонгон урхиар аван О157 латекс наалдуулах урвалыг зааврын дагуу тавина.

ii) Латекс наалдуулах урвалаар эерэг гарсан колонийг антибиотикийн нэмэлтгүй хатуу тэжээлт орчин дээр тарилт хийнэ.(жишээ нь 5% хонины цустай агар) Дулаан тогтоогуурт 37°с±2°с-д хонуут тавина.

d)  E.coli-г баталгаажуулах нь

i) о-нитрофенил бета-D-галактопиранозид (ONPG)шөлөнд эерэг сөрөг хяналттайгаар тарилт хийн агаартай нөхцөлд 37°с-д хонуут дулаан тогтоогуурт тавина. E.coli нь β галактозидазыг шар өнгө үүсгэн задладаг ба энэ нь  эерэг урвал үзүүлсний шинж юм.

ii) 0.45 μм целлюлоз нитрат мембран шүүлтүүрийн цаасыг Триптон цөстэй агар дээр ариун хямсаа ашиглан тавина. 1μl урхи ашиглан урхи дүүрэн колони аван шүүлтүүрийн цаас дээр эерэг сөрөг хяналтын хамт тавина. Дулаан тогтоогуурт 44°с-д багадаа 17цаг  тавина. Мембран шүүлтүүрийн цаас дээр индол урвал дусаан триптофан ашиглаж буй эсэхийг илрүүлнэ. E.coli нь нил ягаан өнгө үүсгэдэг ба энэ нь эерэг урвал үзүүлсний шинж юм.

iii) Олон янзын индол тестүүд худалдаанд байдаг. Голдуу уг урвалжийг шүүлтүүрийн цаасан дээр дусаан колонитой холин өнгөний үүсэлтээр нь тодорхойлдог.

iv) Өөр нэг сонголт нь худалдаанд зарагддаг биохимийн цомгуудаар E.coli-г батлах юм.

е) Эх биеийн антигенийг илрүүлэх

i) Ариутгасан урхи ашиглан тусгаар ганц колони сонгон өлгөн авч 4мл  Schlecht шөлөнд хийн 37°с±2°с-д хонуут тавина

ii) Хуруу шилтэй Schlecht шөлтэй өсгөвөрөө 100°с-д 1 цаг буцалгана.

iii) 0.85%  25μl давсны уусмалыг U хэлбэрийн хавтангын 2-12 үүрэнд хийнэ. 50μl О157 –н эсрэгбием агуулсан ийлдсийг 1-р үүрэнд хийнэ. Дээрх ийлдсээ 1/1024 хүртэл давхар шингэлэлт хийх ба сүүлчийн шингэлэлт дуусмагц сайтар холин 25μl-г асгана.Тэгээд 50μl буцалгасан шөлөн өсгөвөрөөс 1-12 хүртэлх үүрнүүдэд хийн хавтанг сайтар таглан 37°с-д 6 цаг тавина. Хар өнгөтэй дэвсгэр дээр хавтанг тавин наалдуулах урвалд үнэлэлт өгнө.

f)  Веро эсийн өсгөвөрт хор ялгаралтыг тодорхойлох шинжилгээ

i) Ариутгасан урхи ашиглан тусгаар ганц колони өлгөн авч 4мл Mundell шөлөнд тарилт хийн 37°с-д хонуут тавина.

ii) Хор агуулаагүй сөрөг хяналт болон дулаанд тэсвэргүй дотуур хор(LT), эсийг үхжүүлэгч хор(CNF), веро эсийг хордуулагч хор(VT) зэргийг агуулсан нянгуудыг эерэг хяналт болгон дээрх шөлөнд тарилт хийн 37°с-д хонуут тавина.

iii) Веро эс (Африкийн ногоон сармагчингын бөөрний эс АТСС,CCL81 2×10‾5 өтгөрүүлэгтэй ) тэгш үүртэй хавтанд үүр тус бүрд 200 μl хийн 5% СО2 –той дулаан тогтоогуурт 37°с±2°с-д 24 цаг тавина (халдвар хийхээс 24 цагийн өмнө).

iv) Хонуут өсгөвөрлөсөн шөлөн өсгөвөр тус бүр полимиксин B сульфат 400.000нэгж/мл агуулсан уусмалаас 100 μl хийн 37°с±2°с-д 5 цаг тавина.

vi) Шөлөн өсгөвөрүүдийг 3000 эрг/мин-д 30 мин хурилдуурдана.

vii) Тунасан дээд шингэнээс тэмдэглэсэн хуруу шилэнд 1.5 мл-г хийнэ.

viii) Дээрх хуруу шилтэй шингэнээс 10 μl-г тохирох веро эс агуулсан хавтангын үүрэнд хийн  5% СО2 –той дулаан тогтоогуурт 37°с±2°с-д  3 хоног тавина.

iх) Веро эсийг 24,48,72 цагын дараа эсэд эмгэг үүсгэж байгаа эсэхийг шалгана. Эерэг сөрөг хяналттай харьцуулж жишнэ. VT эерэг дээж веро эсийг бага зэрэгхарлуулж хананаас ховхорч задран хорчийж харагддаг. Энэ шинж тэмдэг 24-72 цагын дотор ажиглагддаг.

g) VT1, VT2 болон еае генүүдийг илрүүлэх Мултиплекс ПГУ

Энэ төрлийн ПГУ нь хоруу чанарыг нөхцөлдүүлэгч генүүдийн тодорхой хэсгийг доорх дараалал бүхий олигонуклеотидын тусламжтайгаар нэг зэрэг илрүүлэх боломжийг олгодог.

i) Ариутгасан урхи ашиглан тусгаар ганц колони өлгөн авч Luria Bertani шөлөнд хийн 37°с±2°с-д  хонуут өсгөвөрлөнө.

ii) Шөлөн өсгөвөрийг 100°с-д  15мин буцалгана.

iii) 1 дээжинд 48 μl хэмжээтэй доорх мастер холимгийг бэлтгэнэ.

1× Сайки буфер (50mМ KCl;  10mМ Tris, pH 8.5;  100 μg/ml желатин), 3mМ  MgCl2; 0.5U Taq полимераза , 25 pmol праймерууд, 0.2 mМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP

iv) Цодонтой холимгыг сайтар сэгсэрч холин 48 μl-г ПГУ-н цодонд хийнэ.

v) 2 μl буцалгасан өсгөвөрөөс зохих цодонд хийнэ.

vi) ПГУ-г эхлүүлэх ба дулаан сэлгэгч автомат төхөөрөмжийг ашиглана. Эхлээд 94°с-д  2 мин тавин эхний тунадасжуулалтыг явуулна. Нийт 24 мөчлөгтэйгээр явуулах ба мөчлөг бүр нь 94 ◦с-д  1 мин, 62 ◦с-д  1.5 мин,72◦с-д 5 мин зэрэг дарааллуудаас тогтдог. Электрофорезэд гүйлгэх хүртлээ шинжлэгдэхүүнээ  4 ◦с-д байлгана.

vii) 15 μl ПГУ шинжлэгдэхүүнээ электрофорезийн аппаратанд царцаасан 1.5% агарийн гел бүхий Е буферийн нүхэнд хийн цахилгаанд залган явуулна.100 bp хэмжээтэй маркерийг жиших хэмжээс болгон явуулна.

iх) Этидиум бромидтой (Уг бодис нь маш хортой канцерген бодис агуулдаг тул бээлийтэй харьцах ба нэрмэл устай танканд дор хаяж 20мин байлгана) танканд шинжлэгдэхүүн бүхий гелээ хийн тодорхой хугацаанд үйлчлүүлэн дараа нь хэт ягаан туяаны трансиллюминаторын тусламжтайгаар шинжилнэ.

х) Эерэг хяналтын VT1,VT2,eae генийн ампликоныг дээжнийхтэй харьцуулж үр дүнд анализ хийн протоколдоо тэмдэглэнэ.

2. Серологийн шинжилгээ

Хүний ийлдсэнд VTEC-г илрүүлэх серологийн шинжилгээ хийх нь ялангуяа ялгадсанд үүсгэгчийг ялган авах боломжгүй болсон үед ач холбогдолтой байдаг.Харин дээрх шинжилгээ нь мал амьтны хувьд ашиглагдаггүй. Хэдий тиймч E.coli О157:Н7-н халдвартай үхэрт О157-н липополисахаридын эсрэг үүссэн эсрэгбием сар гаруйн турш илэрч байжээ. Гэвч О157-н ЛПС-тэй  бусад ЛПС-н антиген болох E.coli О55, Salmonella spp, Yersinia.enterоcolitica, Brucella.abortus, V.cholerae non-O1 зэрэгтэй солбицох урвалд орж байсан мэдээллүүд тэмдэглэгджээ. Дээрх солбицох урвалыг бууруулахын  тулд E.coli О157-н ЛПС-н  эсрэг өвөрмөц дан язгуурт эсрэгбиемийг ялган авч шууд бус Элиза урвалд ашиглах ажил хийгдэж байна.Үхрийн ийлдсэнд хор саармагжуулах болон веро эс эмгэгшүүлэх урвалаар VT1-н эсрэг эсрэгбием илэрч харин  VT2-т илрээгүй байжээ.